毒理学实验教学中原则的应用探索

毒理学研究主要以体外研究、整体动物实验和人体观察相结合为主要手段。在研究过程中常常会使用大量动物。如何尽可能减少实验动物数量，减少实验动物的痛苦，并充分利用每只动物，是每个毒理实验需要关注的内容。毒理学中的“3R”原则指“优化”(refinement)实验方法和技术，“减少”(reduction)受试动物数量和痛苦和“替代”(replacement)整体动物试验模式。通过3R原则，可明显减少动物的使用量[1]。以“3R”实验为导向设计的实验方法被定义为毒理学替代法。例如，传统的LD50检测方法需要使用大量的动物，以“3R”原则为导向设计的“固定计量法”、急性毒性分级法、上下法等可以使动物使用量大大减少[2]。但是，在本科生实验教学中，“3R”原则还没有真正落实，仍然存在使用实验动物数量过多和动物利用不充分的问题。

1 毒理学实验教学中存在的一些问题及解决路径

在本科毒理学实验教学中，一般开设的实验课程需要用到不少实验动物，如染毒方法、生物材料采集、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和精子畸形试验。除教师示教用小鼠外，每次每位学生至少使用1只小鼠，一般情况还得多准备若干只小鼠备用。

每次课程有其特定的有限教学目的，小鼠也只能发挥较单一的作用。例如“生物材料采集实验”，主要目的是要求学生掌握小鼠脏器的位置和摘取方法，并计算部分脏器的脏器系数；“微核实验”每次都用同样的样品处理小鼠，并且在小鼠剖杀后，只取胸骨，挤出骨髓涂片染色观察，其它脏器不被有效利用；精子畸形实验中，剖杀前35 d给药，剖杀时只使用了附睾尾，处理时间长，利用率低。为防止污染，备用小鼠在课程结束后不能再放回鼠房，通常使用颈椎脱臼处死[3]。

实验课程可以像科研课题那样，选定某特定化学物，针对特定科学问题，合理设计，将一些传统单项实验课程进行合理整合，这样就能通过一次实验课达到传统单项课程多次课的实验教学目的，大大提高教授学生基础毒理实验知识和训练基本实验技能的课程效率，还可以优化实验流程、方法和技术，减少使用动物数量，用生物材料的检测替代整体动物实验，实现“3R”原则。因为是类似科研课题的教学实验设计，还可以引导学生利用专业知识解决实际问题或科学问题，培养学生创新力。

在安徽医科大学公共卫生学院2015级食品质量与安全专业的本科生实验中展开了试点。受试物为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)。

2 以“3R”原则为导向的实验教学试点

2.1文献检索 DEHP是塑料中含量较高的一种塑化剂，以非共价结合方式存在于塑料中，很容易转移到环境中。生活中，常用的塑料制品如水杯、碗筷和包装袋等都含有DEHP，并能够转移到饮料、饭菜和零食里，进入机体产生毒性作用，属于食品毒理学范畴。为了解DEHP的相关毒性作用，首先布置学生进行相关文献检索和阅读，认识到DEHP有抗雄激素和拟雌激素作用，是环境内分泌干扰物，且具有生殖毒性、发育毒性和致癌作用；然后引导学生针对DEHP的毒性作用特点，分析和提出一些小的科学问题并设计相应的解决方案，进行大学生创新研究设计。

2.2小科学问题的提出和解决方案分析 (1)与非遗传毒性致癌物不同，遗传毒性致癌物通常具有致突变性。DEHP是否有致突变作用？致突变作用是发生在体细胞还是生殖细胞中呢？本科生实验中的“小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验”是用于检测DNA断裂剂和非整倍体诱变剂的致突变性检测方法，可检测外源化学物对体细胞的致突变性；“小鼠精子畸形”实验可以反映雄性生殖毒性，阳性结果还提示受试物可能具有生殖细胞致突变性。(2)DEHP是环境内分泌干扰物，是否会影响动物血清中的性激素水平？可以通过麻醉下经眼内眦取血方法，保留血液样品，制备血清超低温保存备用，后期用ELISA法检测激素水平，获得DEHP影响内分泌的血清学证据。(3)具有内分泌干扰特性的DEHP是否影响组织器官性激素受体表达？小鼠麻醉取血后脱颈处死，摘取各脏器，部分多聚甲醛固定备后期冰冻切片用于性激素受体的免疫组织化学；部分超低温保存，后期匀浆提取蛋白和核酸，用于Western-blotting和RT-qPCR检测性激素受体蛋白和mRNA的表达水平。

2.3实验方法的选择和设计 (1)实验教学项目：课堂教学完成实验动物生物材料的采集、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形制片；课后有兴趣的学生跟随硕士研究生进行ELISA法检测激素水平，激素受体的免疫组化、Western-blotting和RT-qPCR等拓展项目。(2)染毒方法：因为“小鼠精子畸形”实验从给药到剖杀耗时较长，且教学中主要训练学生制片方法，因此依据小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验的急性染毒进行。小鼠禁食后，根据雌雄各半的原则和按体重半随机分组法分为5组，包括阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺；阴性对照组，灌胃给予不加DEHP的乳糜制剂；低、中、高剂量组，灌胃给予不同剂量的DEHP乳糜制剂。提前24 h给药1次。(3)实验流程：给药24 h后，称体重，麻醉下经眼内眦取血，常规制备血清，超低温保存备用。完成取血后，脱颈处死小鼠，胸骨骨髓涂片行微核试验，取附睾尾行精子制片备后续染色观察，摘取各脏器称重，部分多聚甲醛固定备用，部分先液氮速冻，后转移到-80 ℃超低温保存备用。

文章来源：《中国药理学与毒理学杂志》 网址: http://www.zgylxydlxzz.cn/qikandaodu/2021/0319/542.html